PMA光解仪用于生物膜存活率检测

发布时间：2024-05-07 作者：上海路阳仪器技术文档组 点击次数：

本篇摘要

LUYOR-3419 PMA 光解仪用于生物膜存活率检测：465~475nm LED 从两侧与底部三向照射 24 孔样品，每孔 7900 µW/cm²，10 分钟完成 PMA 光解，配合 qPCR 与宏基因组区分活死菌。

核心要点

PMA 只能穿透破损细胞膜，与死菌 DNA 结合后阻止其扩增
光解必须充分且均匀，否则死菌 DNA 残留会造成活菌数高估
LUYOR-3419 从两侧与底部三向照射，24 个 1.5~2 mL 管位同时处理
文献条件：465~475nm、每孔 7900 µW/cm²、光照 10 分钟、中途混匀一次

用 qPCR 数细菌有个老问题：它不区分活菌和死菌。DNA 还在，就能扩增出来，于是消毒后的样品常常"死菌活算"。PMA 解决的正是这个——它只进得去膜破损的细胞，进去后把 DNA 锁死，从此不再被扩增。

农业农村部农业环境保护研究所发表文献《Revealing the Viable Microbial Community of Biofilm in a Sewage Treatment System Using Propidium Monoazide Combined with Real-Time PCR and Metagenomics》，文献中的实验使用了我公司生产的LUYOR-3419 PMA光解仪，使用单叠氮丙啶（PMA）结合实时定量聚合酶链式反应（qPCR）和宏基因组技术，评估污水处理系统中生物膜的存活率以及存活群落的组成和功能。

文献摘要：

PMA Condition Optimization

We took 500 μL of viable E. coli suspension and dead E. coli suspension (the concentration was 1 × 10⁸ CFU/mL [47]) and put them into 1.5 mL transparent PVC centrifuge tubes, respectively, and then added 500 μL biofilm suspension. The mixtures were thoroughly vortexed. Different volumes of PMA solution (Upland Co., LTD.) were added to achieve final PMA concentrations of 0, 4, 8, 12, 16, and 20 μM. After thorough mixing, the samples were incubated in the dark at room temperature for 5 min and then exposed to light for 10 min using the LUYOR-3419 LED photoreactor (LUYOR INSTRUMENT CO, LTD). The samples were mixed once for 5 min. The LUYOR-3419 LED photoreactor provided uniform and maximal illumination to 24 × 1.5−2 mL vials, using illumination long-lasting LED lights with 465–475 nm emission from both sides and the bottom to all vials for efficient activation of PMA. The distance between the three light sources and vials was 5 mm, with a strength of 7900 μW/cm² for each vacancy. Subsequently, they were centrifuged at 12,000 rpm for 2 min at 4 °C, and the supernatant was discarded while the sediment was retained for DNA extraction and qPCR detection. Three repetitions were performed in each condition.

文献地址：https://doi.org/10.3390/microorganisms12081508

PMA光解仪用于生物膜存活率检测(pic1)

相关产品：LUYOR-3419 PMA光解仪（LED photoreactor）。

PMA 的原理

叠氮丙啶（PMA）是一种光敏染料。完整细胞膜把它挡在外面；膜受损的死菌则挡不住，PMA 进入细胞并与 DNA 结合。随后经可见光照射，PMA 的叠氮基团转化为高活性氮宾，与 DNA 共价结合，形成稳定的加合物。

这种修饰会阻止 DNA 聚合酶沿模板前进，于是在后续 qPCR 中，来自死菌的 DNA 不再扩增，只有活菌的 DNA 被检测到。结合 16S 测序或宏基因组，还能进一步分析存活群落的组成与功能。

光解条件为什么关键

PMA 的光解需要足够的光子剂量，也要照得均匀。剂量不足，死菌 DNA 未被完全封闭，活菌数被高估；照不均匀，同一批样品里不同管位的有效剂量不同，平行样之间差异变大。

农业农村部农业环境保护研究所的文献给出了可复现的条件：取 500 µL 活菌与死菌悬液，加入 500 µL 生物膜悬液，涡旋混匀；加入 PMA 使终浓度分别为 0、4、8、12、16、20 µM；室温避光孵育 5 分钟后，用 LUYOR-3419 LED 光解仪光照 10 分钟，中途混匀一次。仪器从两侧与底部三向照射 24 个 1.5~2 mL 管位，光源为 465~475nm 长寿命 LED，光源与管壁距离 5 mm，每个位置强度 7900 µW/cm²。之后 4 ℃、12000 rpm 离心 2 分钟，弃上清留沉淀进入后续提取。