同一块平板上怎么分出红白两种菌：LUYOR-3421 在竞争实验里的用法

一、这项研究为什么必须"数菌落"

中科院微生物研究所 2026 年在 mLife 发表的一项工作，回答的是鲍曼不动杆菌为什么这么难缠：除了耐药，它还有一套"留下来、扛得住"的本事。作者先扫了 582 个完整基因组，又并入 6908 个草图基因组（合计 7490 个），在其中找到一类反复出现的扩增——两端被 ISAba1 夹住的 crp-osmC 基因簇，出现在 19 个基因组中（3.3%），拷贝数 2 到 8 不等。这个可移动单元后来被登记为 Tn7691。

为了验证扩增到底带来了什么，作者把"ISAba1-crp-osmC"克隆进 pKFAb 质粒，导入敏感模式菌 ATCC19606，qPCR 证实 crp 拷贝数提高到 6.23±1.97 倍。随后的表型很清楚：稳定期长得更高（12 h 之后才拉开差距）、在小鼠肺和肠道里定植更多、在血清里活得更久；代价是生物膜变薄、对多种抗生素反而更敏感。

这些结论有一个共同的基础动作：把两种菌从同一块平板上分开、数出来。竞争指数、定植比例、血清存活倍数，全部是从菌落计数推出来的。所以方法部分那句"Colony ratios were determined using a LUYOR-3421 benchtop fluorescent protein excitation source"，不是一句设备致谢，而是整套结论的测量环节。

二、为什么非得用荧光：抗生素标记在这里失效

竞争实验的设计要求很苛刻：两株菌除了待测的那段基因，其余尽量一致，谁都不能因为"被标记"而获得或失去生长优势。常用做法是给其中一株加抗性基因，用对应的抗生素平板筛选——但在这篇论文里走不通。

因为两株都带 pKFAb 质粒，都携带 kanR。同样的抗性，抗生素平板就分不开它们。作者的解决办法是：给对照株的空载质粒里插入 mCherry，得到 19606 (pKFAb:mCherry)；被检株是 19606 (pKFAb:crp-osmC)，不带荧光。空载这一点很重要——标记带来的代谢负担由对照株承担，才不会把"扩增的收益"和"荧光的代价"混在一起。

于是平板上只剩一种可用的判读方式：菌落本身长得一样，都是奶油色、圆形、边缘整齐，差别只在红色荧光。这也是台式荧光蛋白激发光源在这类实验里几乎不可替代的原因——它把"看不见的差别"变成"一眼能数的红点"。

三、3421 在流程的哪一步，用哪个模块

完整链条是这样的：过夜培养 → 稀释到 5×10⁶ CFU/ml → 1:1 混合 → 37 ℃ 共培养 → 0、3、6 h 取样 → 梯度稀释 → 点 LB 平板（含卡那霉素）→ 37 ℃ 过夜 → 用 3421 判读菌落 → 抽单菌落做 PCR 复核。

被检株不带荧光，对照株的空载质粒里插入了 mCherry；扩增株拷贝数约 6 倍，稳定期生长更高（文献 Fig. 1）

mCherry 的激发峰在 587 nm、发射峰在 610 nm 附近。3421 的 GR 模块用 510–540 nm 激发、600 nm 长通滤光，把发射端让给红色；产品资料里把 DsRed、TdTomato、mCherry 都归在 GR 模块下，就是这个道理。同一台机器换模块就能看 GFP：RB 是 440–460 nm 激发配 500 nm 长通，RB-G 把发射收窄到 500–560 nm 带通，用来压掉叶绿素和培养基的红尾。

台式机型在这类实验里的实际好处有两条。一是 20 W LED 加较大的照射面积，一块 90 mm 培养皿一次就能看全，几十块板可以流水看过去；二是 BNC 快换接口，双标实验（比如 GFP 标记的宿主加 mCherry 标记的质粒）换模块只要几秒，不用二次对光。

四、把菌落数压进能数的区间

荧光判读的成败，八成在铺板这一步。菌落太密，红色菌落彼此贴在一起、和白色菌落叠着长，再好的光源也分不清；太稀，比例的分母太小，竞争指数会剧烈跳动。

1. 起始浓度：论文用 5×10⁶ CFU/ml，1:1 混合。这个浓度保证 6 h 内两株都还在对数期，不会因为营养耗尽同时进入稳定期而掩盖差异。

2. 取样时间：0、3、6 h。0 h 的板必须做——它是竞争指数的分母（初始比例），不是可有可无的对照。

3. 稀释梯度：每个时间点至少铺 2–3 个稀释度，取菌落数在 30–300 的那一档计数。经验上 100–200 个菌落数起来更稳，红白比例的分辨率也够。

4. 涂布量：100 μl 涂布，玻璃珠摇匀比涂布棒更均匀；板面要先干燥，表面有水膜时菌落会连成片。

5. 抗生素浓度：卡那霉素按质粒选择浓度加，常用 50 mg/l。浓度偏低会冒出大量丢质粒的卫星菌落，它们不发红光，会被当成被检株。

6. 重复数：论文体外竞争每组至少 6 个生物学重复，动物实验每组 8 只。CI 是比例型的量，重复少一个，结论就可能翻。

五、判读：白光数一遍，红光数一遍

看图 2A 就明白这块板长什么样：同一块板，左边是白光下的样子，右边是红光激发下的样子。0 h 时红点密、白点也密，比例接近 1:1；6 h 时红点明显变稀——mCherry 对照株被挤掉了，这就是竞争劣势的直接证据。

同一块平板的两种读法：左为白光，右为红光激发。0 h 红白相当，6 h 红色菌落明显减少（文献 Fig. 2A）

操作上按这个顺序来，别改：

1. 关掉室内照明，把平板放到灯头下，盖上配套的观察罩，或者戴滤光眼镜。环境光一进来，弱表达的菌落就看不见了。

2. 先在白光下数总数，用记号笔在皿底点标，或者直接按计数器。总数包含红色和白色两类。

3. 换 GR 模块，在红光下数红色菌落。这一步要慢：边缘的、长得小的、被大菌落压住的，都要翻动平板从不同角度看。

4. 白色 = 总数 − 红色。不要在荧光下直接数白色菌落——不发光的菌落在暗背景上几乎是黑的，数不准。

5. 拍照留档：灯头前加 67 mm 滤镜，相机或手机固定高度、手动曝光，同一批板的参数不要变，方便事后复核。

五个容易踩的坑：

• 顺序反了：先数红再数总，红色菌落会被重复计一次，白色被系统性低估，CI 虚高。

• 培养过久：超过 24 h，丢质粒的细胞会长成白色"扇形"菌落，看起来像被检株。挑单菌落时避开扇形，或者干脆缩短培养时间。

• 培养基自发荧光：LB 里的酵母提取物在蓝光下有黄绿背景，红通道影响小；但如果做 GFP，背景会很脏，这时用 RB-G 的带通滤光比长通干净。

• 皿盖反光：塑料皿盖在斜射光下会出现高光斑，正好盖住菌落。看的时候把盖子拿掉，或者把平板倾斜 15°–30°。

• 手机闪光灯：补光会压掉荧光对比，红光下几乎全白。要么关掉，要么用固定光源。

六、从菌落数到竞争指数：算法与误差

竞争指数（competitive index，CI）的定义很朴素：输出比例除以输入比例。

CI =（被检株 CFU ÷ 对照株 CFU）_输出 ÷ （被检株 CFU ÷ 对照株 CFU）_输入

CI 等于 1 表示两株打平，大于 1 表示被检株占优。论文所有图上的虚线都画在 1.0，就是为了让读者一眼看出偏离方向。

拿图 2A 那块板演算一遍。假设 0 h 板上红色 50、白色 50；6 h 板上红色 18、白色 82：

这个 4.56 落在论文体外 6 h 的 3.45±0.67 之外一点点，完全正常——单块板的 CI 波动本来就大，论文报的是 6 个重复的均值。

误差主要来自分母。假设一次只数到 10 个红色菌落：红 3 白 7 时 CI 是 2.33，红 4 白 6 时是 1.50。同样是"看起来差不多"的两块板，CI 差了 0.8。这也是论文里血清竞争那组标准差特别大（9.00±5.69）的原因：血清里活下来的菌本来就少，能数到的菌落有限。想让 CI 稳，办法只有一个——把每块板的菌落数做上去，或者增加重复数。

七、这套计数支撑起了哪些结论

体外 3 h 的 CI 是 3.06±0.88，6 h 是 3.45±0.67：扩增株在共培养 3 h 就已经占优，6 h 维持在同一量级，说明优势不是"起跑快"而是持续存在。动物实验里，肺部 CI 3.56±0.97 高于肠道 2.12±0.79，作者的解释是肺部的营养限制和免疫压力更强，代谢灵活性带来的收益更容易体现。血清里 6 h 的存活倍数是 7.05±2.75，直接把"抗血清杀伤"这条写实了。

有个细节值得注意：用环磷酰胺造成免疫抑制之后，肺部 CI 仍有 5.54±1.98。说明扩增带来的优势不依赖细胞免疫压力——它是代谢层面的，不是躲免疫的。

反方向的代价同样清楚：生物膜变薄（平均厚度 8.56±0.65 μm 降到 7.50±0.48 μm），多种抗生素的敏感性上升。抗生素这部分用的是点板法：把菌液五倍梯度稀释，点到含药平板上，看长到第几个点。这个实验不需要荧光光源，肉眼看浊度就够——同一批菌，两种读数方式，各自解决各自的问题。

抗生素敏感性的点板实验：每块板上下两排分别是空载对照与扩增株，五倍梯度稀释后点样；扩增株在 MEM、CAZ、ATM 等板上长势明显变弱（文献 Fig. 5）

八、荧光法的边界：什么时候必须回到 PCR

这套方法有个前提：能给其中一株加上不改变适应度的荧光标记。实验室菌株 ATCC19606 满足这个前提，临床分离株不一定。

论文在 ST2 临床株上做竞争时换了打法：两株分别是 pKF-ble 和 pKF-ble:crp-osmC，都带博来霉素抗性，抗生素平板同样分不开；作者也没有往临床株里再塞一个荧光蛋白——临床分离株遗传背景复杂，多一个表达元件就可能改变适应度，反倒把要测的差异搅浑。于是改成每块板随机挑 20–24 个单菌落做菌落 PCR，用 cCRP-test-F 与 ISAba1-R 引物区分，按 PCR 阳性比例算相对丰度。代价很直接：一块板上百个菌落只能抽样 20 多个，统计误差比荧光计数大得多，只能靠 5 个生物学重复来补。

这条对比给出了一个清晰的判据：

• 标记不影响生长、且两株抗性可区分 → 荧光计数，通量高、误差小；

• 标记会影响适应度、或两株抗性相同 → 挑克隆做 PCR，或者用 qPCR 测拷贝比；

• 只需要定性（有没有扩增、是不是同一株）→ PCR 就够，不必上荧光。

顺带一句：如果只是想确认"荧光株是不是还带着质粒"，在荧光下看有没有白色扇形菌落，比测序快得多，是很省事的一次质控。

九、把方法搬回自己实验室

六条上机清单：

1. 先定标记，再定判读：GFP 用 RB（440–460 激发 / 500 长通），需要压背景时用 RB-G（500–560 带通）；mCherry、DsRed、TdTomato 用 GR（510–540 激发 / 600 长通）。

2. 每批带两块对照板：一块纯 mCherry 株、一块纯野生型，用来确认红白判读阈值没有漂移。这两块板同时能发现"质粒丢了"。

3. 先白后红，红色数完立刻记，别攒到最后一起回忆。

4. 拍摄参数固定：高度、曝光、滤镜一致，同一批图要出自同一次设置。

5. 留原始计数：每块板的总数、红数、稀释度都记下来，CI 事后可以重算，漏记就补不回来。

6. 双人盲读：CI 差异在 2 倍以内时，建议两人各读一遍取均值，或者拍照后用 ImageJ 计数复核。

如果实验里同时要看植株、叶片这类大体样本，台式机反而不顺手，手持的 3415RG 更合适；只做平板批量判读，3421 的照射面积和调光更实用。

文献信息：Wei DW, Huang J, Fang H, et al. ISAba1-mediated crp-osmC amplification enhances host-associated fitness in Acinetobacter baumannii. mLife, 2026. DOI: 10.1002/mlf2.70105。设备信息见 Methods 部分"In vitro and in vivo competition experiments"。