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考马斯亮蓝和考马斯亮蓝染色步骤以及常见问题

发布时间:2018-06-27 00:00:00      发布人:   浏览量:220


考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)一定范围内与蛋白质浓度成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,更大光吸收在465nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有更大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。


考马斯亮蓝染色方法

马斯亮蓝染色是用考马斯亮蓝进行蛋白质染色的方法。考马斯亮蓝是一种阴离子染料, 常用考马斯亮蓝G250和R250。考马斯亮蓝 G250在游离状态下呈红色,当它与蛋白质 通过疏水结合后变为蓝色,蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有更大光吸收。其光 吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝G250染色可以同时固定和染色,因此能立即观察显色结果,可用来确定电泳时间,观察初步结果。考马斯亮蓝R250染色灵敏度比G250髙得多,但对酸溶蛋白、醇溶蛋白不合适,因为在染色过程中,蛋白质会溶解在染色液或脱色液中。可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE蛋白电泳的快速染色,或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。(陆惠玲)


考马斯亮蓝沾到皮肤后怎么处理?

考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。

测蛋白用的考马斯亮蓝怎么配的?

测蛋白用的考马斯亮蓝配方
称取考马氏亮蓝G250(注意不是R250)50mg,加95%乙醇25ml溶解,加85%磷酸50ml,H2O定容到500ml,过滤去除少量未溶解物。4度保存备用。

westernblot电泳后,为什么要考马斯亮蓝染色,直接转膜不行吗?
WB的胶用考马斯亮蓝染色,有为了确定你的目的条带电泳情况目的,还有一个目的,就是跟用丽春红染摸一样的作用,看转膜的效率。也就是看你的目的条带是否都转移到你的膜上了。
这步染色完全可以省略,一般都可以用预染Marker来进行转膜观察,另外考马斯亮蓝与蛋白结合后,很难再去除。

考马斯亮蓝染色步骤

考马斯亮蓝染色法也称考马斯蓝法(coomassie blue staining)又称Bradford法。是测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。下面就着重介绍下考马斯亮蓝染色法步骤。

考马斯亮蓝染色

考马斯亮蓝染色步骤:
1 电泳结束后,切取少量含有MARK蛋白以及少许样品的小部分凝 胶进行染色,其余部分用保鲜膜包好,放在4℃冰箱保存。 取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,确保染色液可以充分覆盖凝 胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温染色1小时或更长时 间。 注:具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚, 温度较低,则染色时间宜适当延长。凝胶较薄,温度较高,则染色时 间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近, 在染色液中几乎看不清凝胶时,可以认为已染色充分。染色2-4 个小 时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。

2 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3 次。

3 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液,确保脱色液可以充分覆盖凝胶。 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温脱色 4-24 小时。期间更换脱色液2-4 次,直至蓝色背景基本上全部被脱去,并且蛋白条带染 色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2 小时后即可出现。 注:脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸,可以使部分染料吸附 在吸水纸上,加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。

4 完成脱色后,用ddH2O浸泡,至于未染色凝胶长度相等时,参照 MARK 蛋白,与未染色凝胶对比,切下所需蛋白成分的凝胶,收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。


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