红色·荧光蛋白哪些更靠谱？

从 1962 年下村修等在名为 Aequorea victoria 的 水母体内发现并分离得到最早的荧光蛋白绿色荧光 蛋白(Green fluorescent protein,GFP)开始，人 们对于荧光蛋白的进一步研究和应用都没有停止过。 研究者通过一系列突变得到各种不同波长的突变体, 大大丰富了荧光蛋白的家族成员。如此大量的荧光 蛋白使得其在蛋白质分子标记和细胞内示踪等方面 得到了大量的应用。

在红色荧光蛋白发现以前,GFP 虽然能帮助生 物科学家解决一些问题,但由于其发射光谱仅仅局 限在 440-529 nm,细胞内成像时背景较高,不能够解决活体生物皮下更深的荧光标记问题。1999 年 红色荧光蛋白被报道,红色荧光蛋白能够 与 GFP 共用,激发和发射波长更长,最重要的是其 在细胞内成像时背景低。这些优点促使科学家们对 红色荧光蛋白进行了系列研究,极大的完善了其多 样性。

研究者在应用红色荧光蛋白的时候也发现了一 些问题,如野生型的红色荧光蛋白成熟速度慢且多 以四聚体或二聚体形式出现,对细胞有一定的毒性 作用。最早用于研究的红色荧光蛋白是 DsRed,它是 一种从珊瑚中分离出来的红色荧光蛋白,具有荧光 强、稳定性好等优势。但其本身也存在许多问题。 例如,DsRed 寡聚状态是四聚体,在进行蛋白融合 时容易形成多聚影响目标蛋白 ;DsRed 在细胞内表 达会产生毒性。
常规红色荧光蛋白
常规红色荧光蛋白也叫做荧光蛋白,可以 分为橙色荧光蛋白(550-570 nm),红色荧光蛋白(570-620 nm)和远红外荧光蛋白(>620 nm)3 种。
现代红色荧光蛋白与代常规红色荧光 蛋白相比有增强的荧光特性。例如 mOrange2 和 TagRFP-T 与 他 们 的 祖 先 mOrange 和 TagRFP相比其光稳定性更强。其他橙色荧光蛋白,如 mKO2和 mKOk与其祖先相比更明亮,具有 更快的成熟时间,然而,他们的光稳定性较低。最 近 Bindels 等研究产生的 mScarlet 为单体红色荧 光蛋白,与其他红色荧光蛋白相比更适合作为融合 标签。2016 年 Pandelieva 等在 mRojoA 的发色团 之上引入芳香残基降低发色团的构想灵活性,这种 突变使得其比前提的荧光蛋白量子产率提高了 3 倍 以上。而且通过对突变体的晶体结构表明,发色团 夹在芳环三层基序中的两个 Tyr 残基之间,这种基 序的存在增加了发色团的刚性。Pandelieva提出 的方法为具有较高量子产率和总体亮度的荧光蛋白 的发展提供了一个选择。尽管现代红色荧光蛋白在 某些特定应用方面有一定的优势,但一些早期的红 色荧光蛋白是仍然存在竞争力的。2016 年 Fan报道的 rxRFP1 对于氧化还原反应敏感,能够用于 研究各亚细胞域的氧化还原动力学。通常 mCherry 是作为标签的好选择,因为它的光稳定性更强并且 其具备良好的单体特性,细胞毒性低。2015 年 Wannier 等通过计算设计的手段结合表面突变, 创建了一种 DsRed 和 mCherry 的混合 RFP 不仅保持 了单体性而且荧光不受损,相信这种方法对于以后 的荧光蛋白改造有很大的意义。

目前为止报道的天然 红色荧光蛋白最长发射光波长为 613 nm,是来自Nematostella vectensis 体内的 NvFP-7R 。Ren H 等经过在 mKate2 的发色团附近引入半胱氨酸得到新的远红外红色荧 光蛋白 mStable,该突变体比其前提稳定性增强 12 倍, 而且他们还对 mPlum 进行了同样的改变得到了稳定 性增强 23 倍的突变体,这种突变代表了一种生产更 好稳定性荧光蛋白的一种机制。

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