观察GFP荧光蛋白有哪些方法？

 观察GFP荧光蛋白有哪些方法？

 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白。GFP具有多种优点：易于检测，灵敏度高；荧光性质稳定，耐受性强；易于表达，无细胞毒性；可用于活细胞检测。因此，GFP可作为报告基因用于检测基因表达或调控，或作为融合标签来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。GFP吸收的光谱更大峰值为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm的副吸收峰（蓝光）；发射光谱更大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰（Shouder）。虽然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于该激发光对细胞的伤害更小，因此通常多使用该波段光源（多为488nm）。此外，GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐（FITC）很相似，两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素强，特别是在450～490nm蓝光波长下更稳定。类似的，GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白，比如萤火虫荧光素酶等。

观察GFP荧光蛋白方法有：

1.便携式GFP激发光源：

采用便携式GFP激发光源(又叫荧光蛋白观测镜）是最便捷、最方便的观察方法，因GFP在470nm有一个很高的吸收峰，采用 470nm激发光源能够激发GFP发出明亮的绿色荧光，在观察gfp荧光时，因为激发光为强烈的蓝色光线，必须佩戴专业的观察眼镜才能观察到清晰的荧光信号。推荐使用美国路阳LUYOR-3260便携式激发光源。

上图为采用便携式GFP激发光源观察到的效果

2. 紫外光源：

采用紫外光源（又叫紫外线灯、黑光灯）观察也非常方便，但如果观察植物，植物叶片的叶绿色在紫外线灯下也会发出荧光，对gfp发出的荧光也会产生干扰，另外，标本长时间在紫外光源照射下对GFP标本组织也会造成破坏。

上图为紫外线灯照射含有GFP叶片的效果。

3.荧光显微镜

 荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。目前在常用的方法就是采用荧光显微镜观察，荧光显微镜在实验室非常普及，但的不足是必须采集叶片或动物切片进行观察，对培养的标本进行破坏，无法进行活体观察。

上图为荧光显微镜观察GFP的效果。

综合分析，采用采用便携式GFP激发光源（又叫转基因生物观测镜）是观察荧光蛋白GFP最便捷、最方便的方法.