激发光源用于植物遗传转化研究

发布时间：2024-09-24 作者：上海路阳仪器技术文档组 点击次数：

本篇摘要

激发光源用于植物遗传转化研究：中科院华南植物园建立 RAPID 茎段注射转化法，效率提升 20~100 倍，用 LUYOR-3415RG 便携光源观察 GFP 表达，快速确认阳性器官与转化个体。

核心要点

传统植物遗传转化流程复杂、效率低，是资源植物开发的技术障碍
RAPID 法利用植物自身再生能力，通过茎段注射递送，效率提高 20~100 倍
GFP 报告基因让阳性器官在活体上直接可见，不必等分子鉴定
方法已用于甘薯、马铃薯、厚藤等无性繁殖作物

植物遗传转化长期是个瓶颈：方案复杂、效率低、高度依赖基因型，很多资源植物根本转化不了。中科院华南植物园另辟蹊径——不去对抗植物，而是利用它自己的再生能力。

中国科学院华南植物园农业生物技术研究中心在线发表《A simple and efficient in planta transformation method based on the active regeneration capacity of plants》，文献中使用了LUYOR-3415RG便携式双波长荧光蛋白激发光源用于绿色荧光蛋白GFP的表达。

植物遗传转化技术是植物基因工程和现代农业分子育种的必要工具。然而，现有的植物遗传转化方案复杂且效率较低，制约了多数资源植物或农作物的遗传改造，已成为植物资源开发和利用的技术障碍。因此，开发高效且多应用的植物遗传转化技术已成为植物或农业科研领域的重要研究方向。研究人员经过多年探索和研究，成功建立了一种以植物主动再生能力为基础的新型植物遗传转化方法（Regenerative Activity-dependent in Planta Injection Delivery，RAPID）。该研究利用强再生能力植物甘薯，进行多种递送方式测试，发现通过甘薯茎段注射递送方法能快速获得阳性器官和转化个体，同时在农杆菌菌种、侵染浓度、化学活性剂等方法条件上对转化效率进行优化提升，并完成了多种报告基因和遗传编辑工具的应用，随后通过遗传学和细胞学分析方法确认了植物分生组织高效转染以及新生转化器官个体的快速再生，是迅速高效地获得稳定转基因植株的根本原因。目前，RAPID方法已成功应用于甘薯、马铃薯、厚藤等无性繁殖的经济作物或资源植物。

与传统遗传转化方法相比，RAPID方法具有较高的转化效率（提高20至100倍），操作流程更为简便（缩短2至3倍），且无需昂贵且复杂的组织培养过程。RAPID方法克服了传统方法在快速遗传转化方面的局限性，打破了各类资源植物开发和利用的瓶颈。基于植物主动再生能力及无性繁殖的特点，此方法有望应用于更广泛的植物物种，实现更多特色资源植物和经济作物的性状改良与种质创新，以推动相关领域的基础研究和应用研究发展，为特色植物的高效遗传改良和现代农业育种应用提供理论和方法支撑。

文献摘要：

激发光源用于植物遗传转化研究(pic1)

Fluorescence detection

Fluorescence of the mScarlet reporter in live transgenic tissues was observed under a fluorescence stereo microscope (M205 FA, Leica, Germany) with a red fluorescence filter (Exc 540–580 nm, Em 593–667 nm). The spontaneous fluorescence spectra of sweet potato were observed under a confocal microscope (SP8 STED 3X, Leica, Germany). One-week-old adventitious roots were freshly selected for testing of root samples, and the third mature leaf of nascent shoots was selected for testing of leaf samples. Transgenic sweet potato materials containing the GFP reporter were observed using a dual-wavelength fluorescent protein excitation light source (Exc 440 nm, Em 500 nm, 3415RG, LUYOR, China). The regions near the phloem at the base of the stems were peeled to reduce epidermal autofluorescence, and the whole plant was irradiated with a light source under dark conditions. Green fluorescence was detected in the inner regions of the stems of positively transformed plants.

文献链接：https://doi.org/10.1016/j.xplc.2024.100822

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RAPID：把递送做简单

研究团队建立的 RAPID 方法（Regenerative Activity-dependent in Planta Injection Delivery），核心是"体内注射递送"：利用具有强再生能力的植物（如甘薯），把农杆菌通过茎段注射送入植物体内，依靠分生组织的再生能力长出转化器官与个体。

研究系统测试了多种递送方式，确认茎段注射能快速获得阳性器官和转化个体；同时优化了农杆菌菌种、侵染浓度、化学活性剂等条件，并验证了多种报告基因与基因编辑工具的适用性。遗传学与细胞学分析表明，分生组织的高效转染与新生转化器官的快速再生，是快速获得稳定转基因植株的根本原因。

与传统方法相比，RAPID 的转化效率提高 20 至 100 倍，操作也更简单。目前已在甘薯、马铃薯、厚藤等无性繁殖的经济作物与资源植物上成功应用。

GFP 在其中的角色

效率再高，也要能"看见"成功。研究中用 LUYOR-3415RG 便携式双波长荧光蛋白激发光源观察 GFP 表达，判断哪些器官、哪些新芽是阳性的。

这一步的价值在于"早"和"活"：不必等植株长大取样做 PCR，也不必破坏材料。在培养容器外照一下，发绿光的芽或根就挑出来单独培养，后续再做分子确认。对于转化效率本来就不高的物种，这种早期筛选能省下大量培养空间与人力。

操作与判读

暗环境：组培室照明较强，判读时关灯或遮光，弱表达材料才看得见；
滤光片：观察 GFP 配黄色滤光镜，挡掉激发光；
对照：未转化材料同条件观察，排除组织自发荧光；
记录：固定拍摄参数，记录阳性器官位置与数量，作为转化效率的数据来源；
继代：阳性材料及时分离继代，避免与阴性材料混养。

常见问题

RAPID 法适用于哪些植物？

目前验证的是甘薯、马铃薯、厚藤等具强再生能力的无性繁殖材料。是否有普适性，取决于该物种的再生能力与注射操作可行性。

为什么用 GFP 而不是抗生素筛选？

抗生素只能说明"带抗性基因的细胞活下来了"，GFP 是蛋白层面的直接证据。两者结合最可靠。

便携光源能替代荧光显微镜吗？

宏观筛选可以。需要看细胞定位或拍摄高质量图像时，仍需荧光显微镜或体视镜。

观察会伤害材料吗？

短时间照射不会。避免长时间近距离直射同一部位，需要细看时采取间歇照射。