高强度紫外线灯用于观察GFP在植物叶片上的表达

发布时间：2024-10-22 作者：上海路阳仪器技术文档组 点击次数：

本篇摘要

路阳 LUYOR-3410 高强度紫外灯在贵州大学 iScience 论文中用于观察 PVY-GFP 在本氏烟叶片的表达。本文整理激发原理、暗场拍摄参数与三类判读误区，供温室与大田转基因鉴定参考。

核心要点

GFP 的激发峰在 395nm 附近，365nm 近紫外和 440–460nm 蓝光都能点亮它，难的是让绿光压过叶片背景
贵州大学 iScience 论文用 LUYOR-3410 观察 PVY-GFP 在本氏烟叶片上的表达，喷施处理后按天拍照
活体观察看重的是光斑能盖住整片叶、能带到温室和大田、续航够，不是台式仪器的指标
拍图要关环境光、锁曝光和白平衡、戴 LUV-30A 观察眼镜，否则容易把"表达弱"看成"没表达"
读片时同时看 Mock 对照、叶脉与伤口自发荧光、光斑边缘，这三处是常见的假阳性来源

把 GFP 转进植物只是开头，能不能在叶片上把它"看"出来，取决于激发光够不够强、光斑够不够大。贵州大学发表在 iScience 上的 PVY 抗病毒研究，就是用路阳 LUYOR-3410 便携式高强度紫外灯，在本氏烟叶片上直接观察病毒外壳蛋白与 GFP 融合后的表达。本文把这套实验条件拆开，讲清楚这类观察该怎么打光、怎么拍、怎么判读。

近日，贵州大学在《iScience》（IF 4.6）发表文献《Rational Design of 2H-chromene-based Antiphytovirals that Inhibit Virion Assembly by Out-Competing Virus Capsid-RNA Interactions》，文献中使用路阳仪器上海公司生产的手持式紫外灯LUYOR-3410用于观察GFP在烟草中的表达，LUYOR-3410便携式高强度紫外线灯能够输出高强度的紫外线，大面积辐照，被生命科学研究人员用于GFP表达的观察，也被材料科学研究人员用于聚合物材料固化、以及各种化学材料的紫外辐照。

高强度紫外线灯用于观察GFP在植物叶片上的表达(pic1)

文献摘要

尽管马铃薯病毒 Y（PVY）外壳蛋白（CP）的结构基础的确定为基于 CP 的抗病毒药物设计提供了可能性，但 CP 上的许多特异性残基在调节病毒粒子致病性中的作用在很大程度上是未知的，并且已发现较少的小分子药物作用于这些潜在位点。在本研究中，采用分子杂交策略合理设计了一系列 2,2-二甲基-2H-色烯衍生物。我们筛选了一例植物杀病毒剂C50，它可以与 PVY CP 的 Ser125 形成稳定的 H 键以发挥抗病毒特性。Ser125 进一步确定对 CP-vRNA 相互作用至关重要，使 PVY 病毒粒子组装成为可能。通过与化合物 C50 的竞争性结合，可以显著抑制这种相互作用。该研究增强了我们对抗 PVY 药物机制的理解，并为开发新的 CP 靶向病毒颗粒组装抑制剂提供了基础。

Although the determination of the structural basis of potato virus Y (PVY) coat protein (CP) provides the possibility for CP-based antiviral drug design, the role of many specific residues on CP in regulating virion pathogenicity is largely unknown, and fewer small-molecular drugs have been discovered to act on these potential sites. In this study, a series of derivatives of 2,2-dimethyl-2H-chromene are rationally designed by employing a molecular hybridization strategy. We screen a case of phytovirucide C50 that could form a stable H-bond with Ser125 of PVY CP to exert antiviral properties. Ser125 is further identified to be crucial for CP-vRNA interaction, enabling PVY virion assembly. This interaction can be significantly inhibited through competitive binding with compound C50. The study enhances our understanding of anti-PVY drug mechanisms and provides a basis for developing new CP-targeting virus particle assembly inhibitors.

Agrobacterium infection of PVY-GFP, agent treatment, and photographing
The Nicotiana benthamiana plants were subjected to infestation by Agrobacterium tumefaciens, which carried either pCamPVY-GFP or an empty vector (mock). Following this a solution with target compound C50 (500 μg/mL), NNM (500 μg/mL), and a volume equivalent to DMSO (serving as the control) was applied via spraying onto all of the leaves. At dpai，the leaves of N. benthamiana were examined for GFP using a LUYOR UV light （High Intensity UV Lamp LUYOR-3410 Shanghai, China）, and captured in photographs. The foliage was gathered, rapidly frozen with liquid nitrogen, and subsequently preserved in a refrigerator set at a temperature of -80 ℃.

文献全文下载

高强度紫外线灯用于观察GFP在植物叶片上的表达(pic2) PIIS2589004224024350.pdf

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为什么 GFP 观察要用高强度紫外灯

GFP 的激发峰在 395nm 附近，另有一个吸收带在 475nm，365nm 紫外和 450nm 上下的蓝光都能把它点亮。难点不在"能不能激发"，而在"激发出来的绿光能不能压过背景"：叶片里的叶绿素在紫外下会发出暗红色自发荧光，角质层和蜡质又会把激发光反射回镜头，弱激发时 GFP 的信号就埋在这两层背景里。

提高辐照度的作用很直接——单位面积上的光子更多，同样曝光时间下 GFP 的发射更强，相机可以用更短的曝光把背景压下去。LUYOR-3410 是手持式大面积紫外灯，光斑能盖住一整片本氏烟叶，不必来回挪灯，这是文献里选它做活体拍照的直接原因。

文献里的处理与拍照顺序

这篇研究的操作可以拆成三步：先用农杆菌浸润接种 pCamPVY-GFP（空载体作 mock 对照），再往叶面喷施受试化合物 C50（500 μg/mL）、NNM（500 μg/mL）或等体积 DMSO 对照，然后在指定天数用路阳紫外灯检查 GFP 并拍照。拍完之后叶片立即采下、液氮速冻、-80℃ 保存。

"先拍再冻"这个顺序不能颠倒。取样后叶片失水、细胞结构开始破坏，荧光在几十分钟内就能看到明显衰减，倒过来做就拍不到原始状态。同一批叶片若要兼顾成像和分子检测，拍照这一环节应当排在取样之前、且尽量缩短离体时间。

现场拍摄的六个要点

先关环境光。室内拉帘、关顶灯；温室和大田用黑色遮光布或暗袋罩住植株，只留操作口。环境光每多一档，GFP 的对比度就掉一截。
灯距 20–30cm。太近光斑小、边缘衰减快，一片叶子上出现明暗差，弱表达区会被误判；太远则辐照度不够。
戴 LUV-30A 眼镜。肉眼判断时必须滤掉激发光，否则看到的是一片紫色泛光，绿信号完全被压住。
相机固定曝光。同一批样品用手动模式，光圈、快门、ISO 全部锁定，白平衡定在 5000–5500K 或用 RAW 后期统一，不然后期没法横向比较。
别开 HDR 和自动美化。手机拍摄时关掉 HDR、锁定对焦与曝光，HDR 会把弱荧光"拉"成一片绿，读片时看不出强弱层次。
同株同叶位。对比处理组和对照组时选同一叶位、同一叶龄，老叶的自发荧光明显强于新叶。

三种容易误判的情况

一是叶脉和伤口。叶脉、虫咬孔边缘、机械损伤处的细胞内容物在紫外下也会发绿黄色荧光，形态上呈线状或沿伤口分布，与转化体的斑块状表达不同，先看形状再看亮度。

二是光斑边缘。手持灯斜照时叶片远端辐照度只有近端的一半，边缘区域看起来"没表达"，其实换个角度或挪一下灯就出来了。判断阴性前，先把整片叶扫一遍。

三是过曝。为了看清弱信号把曝光拉长，强表达区会先饱和成白绿色，颜色信息丢失，弱区反而被整体提亮，强弱对比被抹平。宁可欠曝半档，也不要过曝。

稳妥的做法是每批都留一张 mock 对照叶同条件拍摄，把它的亮度当作基线，处理组明显高于基线才算阳性。

常见问题

观察植物 GFP，LUYOR-3410 和 3415RG 怎么选？

3410 是 365nm 单波长高强度紫外灯，适合大面积、弱表达的筛查式观察，比如整片叶扫一遍找阳性株；3415RG 是 440–460nm 蓝光加 520–530nm 绿光的双波长光源，适合同时看 GFP 与 RFP（tdTomato、mCherry、DsRed2），蓝光激发下叶片自发荧光也更低。只做 GFP 且要覆盖大田面积，选 3410；要同株看两种荧光蛋白，选 3415RG。