路阳激发光源用于杨树基因的研究
南京林业大学用 LUYOR-3415RG 观察 GFP 在杨树毛状根与再生苗中的表达。本文讲木本材料整株荧光筛查的做法、三通道拍摄与叠加，以及自发荧光和光漂白的应对。
核心要点
- 南京林业大学在 Pakistan Journal of Botany 用 LUYOR-3415RG 观察 GFP 在杨树毛状根与再生苗中的表达
- 该体系用发根农杆菌诱导毛状根，2–3 个月可获得再生转基因植株，GFP 用于全程跟踪
- 3415RG 提供 450nm 与 530nm 两个波段，可分别观察 GFP 与 RFP，适合木本材料的大植株筛查
- 文献同时用共聚焦 488nm 激光看亚细胞定位，用便携灯看整株表达，两者分工明确
- 木本组织自发荧光强，判读要分通道拍（GFP 505–525nm、自发荧光 655–755nm、明场）再叠加
杨树这类木本植物做遗传转化，周期长、嵌合体多，最怕的是养了几个月才发现是假阳性。南京林业大学发表在 Pakistan Journal of Botany 的毛状根转化体系，把 GFP 当作全程可见的"进度条"：从发根、愈伤到再生苗，用 LUYOR-3415RG 便携式激发光源逐阶段确认。本文讲这套用法在木本材料上的具体做法。
近日，南京林业大学在《Pakistan Journal of Botany》发表文献《OPTIMIZATION OF HAIRY ROOT TRANSFORMATION SYSTEM FOR GENE FUNCTIONAL STUDIES IN POPLAR (POPULUS SPECIES)》，文献中使用了LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源用于观察绿色荧光蛋白GFP在杨树毛状根的表达。LUYOR-3415RG便携式激发光源内置了450nm和530nm两个波段，能够观察绿色荧光蛋白（GFP、eGFP）和红色荧光蛋白RFP（mCherry、tdTomato、DsRed2）在动植物上的表达。已经被国内外数千个科学实验室用于基因表达的观察。
文献摘要：
Poplars (Populus spp.) are one of the most widespread ligneous plants in the world, which have a variety of applications ranging from landscape, agriculture, and industry to research. Although Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transformation method has been widely utilized for poplar genetic manipulation, many defective technique defects such as the time-consuming procedures, and the occurrence of chimeric transformant have emerged. To address these problems, a simple, fast, straightforward and effective gene transformation method by using Agrobacterium rhizogenes to induce hairy roots in poplars was developed, and regenerated-transgenic poplar plantlets were obtained within a period of two to three months. The optimal procedure comprised the usage of poplar apex buds as explants, infection of A. rhizogenes by directly pricking colonies with the cuttings on the agar plates, and improving hairy-root initiation by application of indole-3-butyric acid (IBA) in combination with hairy-root morphological identification. Moreover, the GFP marker gene was applied to track record the expression level of the introduced genes using a portable fluorescence lamp. Further quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and the enzyme activity assay showed that in comparison with the non-transformed control, the transcript abundance and enzyme activity of our target gene (i.e., aspartate aminotransferase) were significantly elevated in the transformed plant lines regenerated from the hairy roots, confirming that the current A. rhizogenes-mediated poplar transformation method is effective and applicable for poplar genetic manipulation and functional genomic study.
GFP fluorescence detection and the subcellular localization
The GFP fluorescence was detected under a confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany). The subcellular localization of the introduced gene was determined by using the 488 nm excitation laser. In addition, the GFP signal for the whole plant was detected by a portable fluorescence lamp (LUYOR-3415, Shanghai, China). The GFP signal (emission at 505-525 nm wavelength), auto-fluorescence (emission at 655–755 nm wavelength) and corresponding bright-field images were photographed at various stages of the transformation procedure.
文献原文下载：
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毛状根体系为什么更需要"整株看荧光"
发根农杆菌介导的转化，外源基因随 Ri 质粒进入被侵染的细胞，长出来的毛状根可能是转化根，也可能混着未转化的根；再生成的芽同样存在嵌合。只看 PCR 结果，要等材料长到能取样；只看抗性筛选，又容易被逃逸株干扰。
GFP 的好处是"看得到"。在体视显微镜下或直接用便携光源照，转化根在蓝光下呈亮绿色，未转化的根只有暗淡的自发荧光，几秒钟就能分拣。等苗长起来再复查一次，能把后期丢失表达的株系提前剔掉。
3415RG 在木本材料上的用法
3415RG 内置 450nm 与 530nm 两个波段，前者配 LUV-30A 眼镜看 GFP，后者配 LUV-50A 看 RFP（mCherry、tdTomato、DsRed2）。对杨树这种叶片厚、蜡质层明显的材料，蓝光波段的优势是不会把叶面照成一片反光，荧光对比更干净。
文献中记作 LUYOR-3415，实际使用的即是这一系列的双波长机型。操作上把植株放在暗处或遮光袋里，灯距 20–30cm，先弱后强地移动光源扫一遍，找到发光区域后再固定位置细看。
三个通道怎么拍、怎么叠
文献给出了明确的波长分工：GFP 发射 505–525nm，自发荧光 655–755nm，另拍明场。三个通道分开采集的好处是后期可以单独看自发荧光，把叶脉、伤口、老化组织的背景识别出来，避免把自发荧光当成阳性信号。
叠加时以明场为底图对齐，GFP 通道用绿色伪彩、自发荧光用红色伪彩，重叠区域若出现黄色，说明该处的"绿"很可能来自背景而不是 GFP——这是判读木本材料时很实用的一条经验。
从毛状根到再生苗的判读节点
- 发根期。看根尖与侧根分生区，转化根的荧光通常在根尖后 2–5mm 处更亮。
- 愈伤期。愈伤组织自身荧光高，判读要看"亮绿"与"暗黄绿"的差别，并与野生型愈伤同条件对比。
- 再生芽。看新展开的小叶，老叶在组培条件下容易积累自发荧光物质。
- 移栽后。看上位新叶，若新叶不再发光，说明表达沉默或株系丢失，应淘汰。
木本材料的三个干扰
自发荧光强。木质素、酚类物质在蓝光下会发绿黄荧光，老茎与伤口处尤其明显。对策是同条件拍野生型对照，只认"比对照明显更亮"的区域。
叶绿素红光。成熟叶片叶绿素含量高，红光会压过弱绿信号。选新叶、或从叶背观察，能明显改善信噪比。
光漂白。组培苗娇嫩，长时间照射后荧光衰减快。看的时候快进快出，需要拍照时一次开灯完成。
常见问题
杨树叶片厚，用 3415RG 能看透吗？
看表层表达没问题，看深层组织要靠切片或共聚焦。便携光源的价值是快速筛查整株，不是替代显微镜。实际操作中可以先把叶片对着光看，找到疑似阳性区域再取样做共聚焦确认。
GFP 和 RFP 能同时在杨树里看吗？
可以，3415RG 双波段分时切换。杨树组织对绿光的反射比对蓝光强，拍 RFP 时要注意灯与镜头的夹角，避免激发光直接反射进镜头。
毛状根阶段就能判定转化成功吗？
只能判定"这条根表达 GFP"，不能判定整株都是转化体。毛状根体系的嵌合率不低，必须等再生苗出来后再复查新叶，并结合 qRT-PCR 或酶活数据确认。
组培间光线亮，影响观察吗？
影响很大。组培架上的白光会让瞳孔收缩、荧光对比下降。做法是关掉局部照明，或用黑色遮光布围出观察区，眼睛适应十几秒后再看，弱表达株才不会漏掉。
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上海路阳仪器有限公司. 《路阳激发光源用于杨树基因的研究》[EB/OL]. 上海路阳仪器有限公司, 2025-01-06. https://www.luyor.net/paper/273.html.
