便携式荧光蛋白激发光源用于观察dsred的表达

发布时间：2024-06-04 作者：上海路阳仪器技术文档组 点击次数：

本篇摘要

便携式荧光蛋白激发光源观察 DsRed 表达：聊城大学在补血草毛状根转化与 CRISPR/Cas9 基因编辑研究中，用 LUYOR-3415RG 双波长光源观察根系红色荧光，白光对照即可判断阳性。

核心要点

DsRed 是红色荧光蛋白，激发与发射波段都比 GFP 长
观察 DsRed 需配红色滤光镜，不能与 GFP 的黄色滤光镜混用
白光 + 荧光两组对照拍摄，阳性根一眼可辨
毛状根转化周期短，配合荧光筛选可快速验证基因功能

荧光蛋白不只有绿色的。DsRed 来自珊瑚，发红光，在植物组织里穿透性更好、受叶绿素自发荧光干扰更小。观察它的方法也略有不同——滤光片要换，判断逻辑却一样：照一下，亮的才是阳性。

便携式荧光蛋白激发光源用于观察 DsRed 的表达

近日聊城大学农学院在《Agronomy》期刊上发表《Agrobacterium rhizogenes-Mediated Genetic Transformation and Establishment of CRISPR/Cas9 Genome-Editing Technology in Limonium bicolor》，文献中实验使用了 LUYOR-3415RG 便携式双波长荧光蛋白激发光源，用于观察 DsRed 在植物根系的表达。

上图：左侧为白光下的观察效果；右侧 F 图：在 LUYOR-3415RG 便携式激发光源照射下，左侧的有明显的 DsRed 的红色荧光，右侧为没有荧光表达。

文献摘要：

Limonium bicolor is a perennial herbaceous plant belonging to the Plumbaginaceae family. It can be used as a dried flower or in cut flower arrangements and serves as a model recretohalophyte. Its genome sequencing has been recently completed. However, the research on L. bicolor is limited by the absence of a highly efficient genetic transformation system. In this study, we established a highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated L. bicolor genetic transformation method. The transgenic hairy roots were induced from the hypocotyl of L. bicolor using A. rhizogenes strain K599 harboring pRdGa4Cas9 plasmid (which carries an expression cassette of 35S::DsRed2). The transgenic shoots were regenerated from hairy root segments (~0.1 cm diameter), and induction efficiency was achieved at. The transgenic shoots with 4–5 rosette leaves were directly planted into the soil to induce the transgenic roots. Therefore, transgenic plantlets were produced. The DsRed2 can be used as a reliable reporter gene in screening transgenic plantlets. Furthermore, we also established a CRISPR/Cas9 system in L. bicolor employing the A. rhizogenes-mediated genetic transformation approach. The highly efficient transformation method and CRISPR/Cas9 system established will provide a valuable tool for functional genomics investigation and trait improvement in L. bicolor.

文献地址：https://doi.org/10.3390/agronomy13092244

文献里的对照拍法

聊城大学农学院在《Agronomy》发表补血草（Limonium bicolor）毛状根转化与 CRISPR/Cas9 基因编辑体系的研究，实验中用 LUYOR-3415RG 便携式双波长荧光蛋白激发光源观察 DsRed 在根系的表达。

论文给出的图很有代表性：左侧是白光下的根系，右侧是在激发光源照射下的同一视野——有 DsRed 表达的根系呈明显红色荧光，没有表达的则暗淡无光。白光图用来看形态，荧光图用来判阳性，两张并排，读者一眼就能理解判断依据。做实验记录时也建议这样拍，后续写文章、做汇报都省事。

GFP 与 DsRed，观察方式有何不同

两者原理相同，差别在波段。GFP 激发峰约 488nm、发射约 507nm，用蓝光激发、黄色滤光镜观察；DsRed 激发峰在 550nm 附近、发射在 580~600nm，需要绿光或黄绿光激发、红色滤光镜观察。

所以同一支双波长光源配不同滤光片，就能覆盖两类蛋白。关键是别配错：用黄色滤光镜看 DsRed，只会看到一片暗；用红色滤光镜看 GFP，同样什么也没有。实验前先确认蛋白类型与滤光片组合，是最省时间的做法。

选择上的经验：GFP 亮度高、成熟快，适合早期筛选与细胞定位；DsRed 及衍生的 tdTomato、mCherry 穿透性更好、光稳定性更强，适合组织深层观察与长时间成像，也常与 GFP 搭配做双色标记。

操作要点与常见问题

暗环境：红色荧光在明亮环境下更难分辨，尽量关灯或遮光；
角度：光源斜射，避免激发光直接反射进镜头；
根系展开：把根轻轻摊在培养皿或黑纸上，避免重叠遮挡；
对照：同批未转化根系作阴性对照，排除培养基或根系自发荧光；
时间：强光长时间照射会引起荧光衰减，观察与拍照尽量一次完成。

常见问题

3415RG 能同时看 GFP 和 DsRed 吗？

可以，换滤光片即可。双波长设计的价值就在这里，同一支光源覆盖两类常用荧光蛋白。

为什么我的红色荧光很暗？

常见原因是滤光片不匹配、激发波段不对、环境光太强，或蛋白表达量本身偏低。先换正确滤光片，再排除环境光。

根系自发荧光会干扰吗？

植物组织有弱自发荧光，但 DsRed 的发射波段相对靠后，干扰比 GFP 小。设阴性对照最稳妥。

能看整株幼苗吗？

可以。调整距离即可覆盖整株，根、茎、叶都能观察，适合早期快速筛查。